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德氏乳杆菌抗噬菌体菌株的筛选及抗性机理研究

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德氏乳杆菌作为乳制品发酵中的重要菌株,在酸奶发酵中主要负责产酸、产生风味物质、改善质地等。但是乳杆菌噬菌体的存在给发酵乳制品的生产造成严重的影响,给生产者带来了巨大的经济损失。为了有效的防止乳杆菌噬菌体的污染和为我国抗噬菌体发酵剂的研究工作提供理论依据,本文以德氏乳杆菌和德氏乳杆菌噬菌体phildb为研究对象展开研究。
   噬菌体诱导细菌细胞裂解导致发酵失败或缓慢,使产酸和乳制品质下降产生巨大经济损失,因而引起了对乳品生物技术和噬菌体生物学研究并且提出了许多防治噬菌体污染的措施,其中选育抗噬菌体菌株就是一种有效的方法。噬菌体抗性菌株通常是通过DNA重组或携带噬菌体抗性基因的质粒的转移获得的,因而赋予所得菌株潜在的安全隐患。而自发突变的方法,由于不涉及基因操作,已被认为是一种简便有效且天然的获得抗噬菌体菌株的方法。本论文利用L.bulgaricus KLDS1.1016和L.bulgaricus KLDS1.1028为宿主菌,采用次级感染的方法筛选自发突变的抗噬菌体菌株,将筛选出的有抗性的7株L.bulgaricus KLDS1.1028抗噬菌体菌株和10株L.bulgaricus KLDS1.1016抗噬菌体菌株进行RAPD-PCR鉴定,然后进行EOP、遗传稳定性、溶源性检测等抗性检测,并对其中的两株抗性菌BIM02、BIM8及野生株进行发酵性能测定。结果显示所筛选的抗性株菌和对应的野生菌的RAPD-PCR电泳图谱一致,经过聚类分析其相似系数都达到80%以上。并进一步证明所有抗性菌均来自对应的野生菌,而非杂菌污染。抗性菌株与噬菌体双层培养均无噬菌斑出现,几乎表现出完全抗性。稳定性及溶源性检测表明均是遗传性稳定的非溶源性菌。无论噬菌体是否存在,两株抗性菌BIM02、BIM8其发酵活菌数、产酸能力都与野生菌相似,且制作的发酵乳黏度也与野生菌株无明显差别,适于作为酸奶发酵菌株。
   所筛选的17株德氏乳杆菌抗噬菌体菌株经过噬菌体吸附试验,表明抗性菌对噬菌体的吸附率明显下降,这说明突变株的突变可能发生在噬菌体的吸附受体上从而干扰了噬菌体的吸附。并且经过提取细胞壁分析受体成分表明噬菌体phildb的吸附受体与德氏乳杆菌细胞壁上与肽聚糖相连的多糖聚合物有关。
   通过PCR等方法对2株野生德氏乳杆菌和17株相应的抗噬菌体菌株进行CRISPR序列的扩增和测序,均检测到CRISPR序列的存在,但经鉴定其抗性均非CRISPR中插入spacer序列而引起的。进一步研究检测发现德氏乳杆菌中存在R-M系统,并扩增获得L.bulgaricusKLDS1.1028和L.bulgaricus KLDS1.1016中的Ⅰ型R-M系统。对组成Ⅰ型R-M系统的三个亚基HsdS、HsdM、HsdR测序并与在GenBank中报道的标准菌株的Ⅰ型R-M系统的亚基进行比较发现其相似系数HsdM达95%以上和HsdR为85%左右。
   本课题结论:筛选出具有抗噬菌体的德氏乳杆菌菌株经测定其发酵性能良好,适于作为酸奶发酵菌株。进一步研究其抗性机理发现抗性菌株噬菌体吸附率明显下降,噬菌体受体与德氏乳杆菌细胞壁上与肽聚糖相连的多糖聚合物有关。并检测出新的噬菌体防御系统CRISPR,但此系统并未产生抗性作用。在德氏乳杆菌中检测到的Ⅰ型R-M抗性机制的存在。
   创新点:
   (1)成功选育出抗噬菌体的L.bulgaricus KLDS BIM02和L.bulgaricus KLDS BIM8菌株并确定其有良好的发酵特性,为今后抗噬菌体菌株的开发奠定基础
   (2)确定德氏乳杆菌噬菌体phildb的受体和与肽聚糖相连的细胞壁聚合物有关。
   (3)推测抗噬菌体的德氏乳杆菌L.bulgaricus KLDS1.1028和L.bulgaricus KLDS1.1016的抗性不是由于新的间隔序列插入CRISPR系统产生的。
   (4)确定德氏乳杆菌L.bulgaricus KLDS1.1028和L.bulgaricus KLDS1.1016中存在R-MⅠ型系统。

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