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梓醇促神经修复作用及其脑可塑性机制研究

作者:万东  作者本人请参看权力声明

导师姓名:谢鹏 

学位授予单位:重庆医科大学 

授予学位:博士

学位年度:2007

专业:马克思主义哲学 

关键词:

摘要:(该内容经过伪原创处理,请直接查看目录)

  • 阿尔茨海默病(AD)是以记忆力减退、认知功能障碍及神经功能受损为主要临床特征的神经退行性疾病,是一种老年性疾病,与机体和年龄的老化密切相关。其病理特征表现为神经细胞内出现神经纤维缠结以及细胞外存在老年斑,且主要分布在前皮质和海马区。其病因及发病机制尚不清楚,治疗上也缺乏有效的方法和手段,因此需深入的研究。目前由于缺乏模拟AD的理想动物模型,AD的基础研究和药物开发进展受限,因而有待建立理想的和适用的AD动物模型;由于高龄以及脑组织中-淀粉样蛋白(A )的沉积是促使AD发生发展的重要原因,因而有待探讨高龄易

  • 目的: 1.观察伴有胸腺瘤的重症肌无力患者(myasthenia gravis with thymoma,MGT)环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)治疗的疗效及副作用; 2.探讨MGT使用CTX治疗前后重复频率电刺激(repetitive nerve stimulation, RNS)的变化规律。 方法: 1.所有研究对象来源于2006年12月至2013年8月第二炮兵总医院神经内科就诊的MGT患者,经筛查共有62例MGT患者接受CTX治疗直至研究结束,男34例,女28例,纳入时最小年龄2

  • 目的和意义: 本研究采用多种认知电位结合认知功能评定(如威斯康星卡片分类测验)、睡眠多导图和交感神经皮肤反应(Sympathetic skin resporlse,SSR)等指标评价卒中后抑郁的认知、睡眠和自主神经功能,并对不同部位、不同病期的卒中后抑郁进行对比研究。目的是:1、对卒中后抑郁的认知、睡眠和自主神经状况有一个完整的认识;2、探讨抗抑郁治疗对卒中后抑郁的认知、睡H民及自主神经功能的变化的影响。3、为卒中后抑郁的临床诊断、治疗和预后判断提供客观的参考指标。因此,本研究将对卒中后抑郁的临床诊治和预

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    目的: 1.观察梓醇对离体培养的SD大鼠皮质神经元生存活性及轴突生长的影响; 2.观察梓醇对大鼠局灶脑缺血后神经功能恢复有无促进作用; 3.了解梓醇能否透过血脑屏障; 4.了解梓醇能否促进脑缺血后神经元轴突和树突生长; 5.了解梓醇能否促进脑缺血后轴突有效芽生,增强突触重构; 方法: 一、离体实验研究离体培养SD大鼠乳鼠皮质神经元,以不同浓度的梓醇干预培养至第6天的神经元,采用MTT法测定神经元生存活力和镜下观察并用测微尺测量轴突长度,了解梓醇对离体培养神经元轴突生长的影响。 二、在体实验研究 1.开颅法制备SD大鼠局灶性永久性脑缺血模型。造模成功后分为模型组、生理盐水组、梓醇低、中、高剂量治疗组和胞磷胆碱阳性药物对照组,同时设立假手术组为对照。以腹腔注射给予不同剂量梓醇为干预措施,首次给药时间分为脑缺血后 6h 或脑缺血后24h,每天给药一次,连续7天; 2.采用Bederson 评分、肌力测试、平衡木试验和前肢技巧性食物抓取试验评价各组神经功能恢复状况; 3.采用高效液相色谱技术定性检测梓醇能否进入脑脊液; 4.采用Golgi-Cox染色显示神经元树突和树突棘,观察梓醇对神经元树突生长的影响; 5.采用免疫荧光组化和 Western blot 检测新生轴突和突触分子标志GAP-43和P38蛋白表达,观察梓醇对脑缺血后神经元轴突新生和突触重构的影响; 6.采用电镜技术观测大脑皮质神经毡内突触数目,观察梓醇对脑缺血后神经元超微结构的影响; 7.采用神经示踪和免疫荧光双标技术显示脊髓颈膨大区皮质脊髓束芽生纤维以及脑缺血灶周围残存大脑皮质与健侧感觉运动皮质区的纤维联系,观察梓醇对长距离轴突芽生的影响; 8.采用免疫荧光组化和Western blot检测各实验组Nogo A、NgR、BDNF和trkB蛋白表达变化,初步探讨梓醇促神经修复作用分子基础。 结果: 一、离体实验结果显示,梓醇对神经元生存活性无明显影响。 二、在体实验结果 1.证实梓醇对脑缺血后功能恢复有促进作用。梓醇对脑缺血后感觉运动功能恢复有促进作用。脑缺血后延迟给予梓醇治疗仍促进大鼠功能恢复。 2.梓醇能够通过血脑屏障给药后40min的大鼠脑脊液,HPLC法检测分析发现在保留时间为10.4min处可见梓醇的紫外吸收峰,与脑脊液加样对照梓醇的紫外吸收峰保留时间相同,表明给药后梓醇分布到大鼠脑脊液中。 3.梓醇促进大鼠脑缺血后神经元轴突和树突生长作用及可能机制 (1)梓醇促进缺血灶周围大脑皮质GAP-43蛋白表达GAP-43是神经元新生轴突的分子标志。梓醇对神经元轴突新生有促进作用。 (2)脑缺血后缺血灶周围大脑皮质神经元树突分支和树突棘密度均明显减少;梓醇可促进树突分叉,增加树突棘密度。 (3)梓醇增强缺血灶周围大脑皮质芽生轴突与健侧感觉运动皮质区的联系绿色荧光显示BDA标记的神经细胞和纤维,绿色荧光强度系数越大反映缺血灶周围大脑皮质内BDA标记纤维的数量越多。红色荧光标记GAP-43表达阳性的神经细胞和轴突,红色荧光强度系数越大反映缺血灶周围大脑皮质具有生长反应的神经细胞和新生突纤维的数量越多。两者共定位呈黄色,显示缺血灶周围皮质新生的芽生轴突已经与健侧感觉运动皮质建立纤维联系;Person 相关系数反映芽生轴突被BDA标记的频度,其值越大反映缺血灶周围皮质芽生轴突与健侧感觉运动皮质区的纤维联系越密切。结果绿色荧光强度系数各实验组间无明显差异(p>0.05),红色荧光强度系数梓醇中剂量组明显大于假手术组、模型组、生理盐水组和胞磷胆碱组(p<0.05),提示梓醇可明显促进缺血灶周围皮质神经元轴突芽生。Pearson 相关系数模型组较假手术组明显增加(p<0.05),梓醇中剂量组明显大于模型组和胞磷胆碱组(p<0.05)。 (4)梓醇增加脊髓颈膨大区健侧皮质脊髓束越边纤维数量大鼠皮质脊髓束在脊髓颈膨大节段集中走行在脊髓后(背)索。正常情况下,皮质脊髓束绝大部分纤维发枝支配同侧脊髓前角,很少越边支配对侧脊髓前角。脑缺血后,模型组健侧皮质脊髓束越边纤维占4.7%±1.3%,较假手术组1.4%±0.5%明显增加(p<0.05),提示健侧大脑半球感觉运动皮质在脑缺血后功能恢复过程可能发挥重要作用。梓醇干预后,健侧皮质脊髓束越边纤维占8.5%±2.1%,较模型组和胞磷胆碱组(5.5%±1.8%)明显增加(p<0.05)。 (5)梓醇促进脊髓颈膨大区健侧皮质脊髓束纤维芽生用绿色荧光显示 BDA 标记的健侧皮质脊髓束,红色荧光显示GAP-43表达阳性的新生轴突纤维,BDA/GAP-43共定位后呈黄色,BDA/GAP-43共定位分析,红色荧光强度系数越大GAP-43表达水平越高;Person 相关系数越大脊髓颈膨大区健侧皮质脊髓束新生的芽生轴突越多。模型组红色荧光强度系数明显大于假手术组(p<0.05);梓醇组较其他各实验组均明显增大(p<0.05);模型组 Pearson 相关系数明显大于假手术组(p<0.05),梓醇组较模型组和胞磷胆碱组均明显增大(p<0.05)。 (6)梓醇下调健侧大脑皮质Nogo-A蛋白表达 Nogo-A阳性细胞呈现红色,分布在损伤侧和健侧大脑皮层、海马、纹状体等脑区。大脑皮层Nogo-A阳性细胞数(个/视野)假手术组为56.33±5.51,模型组为213.33±3.78,差异具有显著性(p<0.05);梓醇中、高剂量组分别为121.5±8.35和100.33±7.5 1,均比模型组、生理盐水组和胞磷胆碱组明显减少(p<0.05)。Westen blot检测结果与此相符。 (7)梓醇下调健侧大脑皮质NgR蛋白表达损伤侧和健侧大脑皮层、海马、纹状体等脑区均可见NgR阳性细胞,胞浆和突起呈绿色,细胞核未着色,具有神经元的典型形态特征。健侧大脑皮质NgR阳性细胞数假手术组、模型组和生理盐水组组间差异无显著性(p>0.05),提示脑缺血后15天,大脑皮质内NgR表达水平接近正常生理状态。梓醇中、高剂量组NgR阳性细胞数均比模型组、生理盐水组和胞磷胆碱组明显减少(p<0.05)。Westen blot检测结果与NgR原位检测结果相符。 4.梓醇对大鼠脑缺血后突触重构的诱导作用及可能机制 (1)梓醇上调脑缺血后脑内突触素蛋白表达突触素(P38)是突触的分子标志,用FITC标记,呈现绿色荧光。阳性着色部位呈大小较均匀的点状或颗粒状,主要分布在神经毡内。 阳性着色部位IOD值模型组和生理盐水组与假手术组差异无显著性(P>0.05),梓醇中、高剂量组均显著高于模型组和胞磷胆碱组(p<0.05)。Western blot半定量分析结果与此基本一致。提示梓醇能上调脑缺血后脑内突触素蛋白表达。 (2)梓醇增加大脑感觉运动皮质神经毡内突触数目电镜下,感觉运动皮质神经毡内突触数目除假手术组外,各实验组缺血侧均比健侧减少。模型组健侧神经毡内突触数目与假手术组差异无显著性(p>0.05),但缺血侧明显少于假手术组(p<0.05),提示脑缺血后存在突触丢失现象;梓醇中剂量组健侧和缺血侧均比模型组和生理盐水组明显增加(p<0.05),但与胞磷胆碱组差异无显著性(p>0.05),提示梓醇对脑缺血后突触重构有明显促进作用。 (3)梓醇促进缺血灶周围大脑皮质新生轴突形成突触连接绿色荧光显示P38标记的突触前末端,红色荧光显示GAP-43表达阳性的轴突纤维,GAP-43/P38共定位后呈现黄色,显示新生轴突形成的突触末端。用Pearson相关系数反映GAP-43/P38共定位频度。Pearson 相关系数越大说明新生轴突形成突触越多。模型组和生理盐水组Pearson相关系数明显大于假手术组(p<0.05),提示脑缺血可刺激新生轴突形成突触连接;梓醇各剂量组均比模型组明显增大(p<0.05),且梓醇中、高剂量组明显大于胞磷胆碱组(p<0.05)。提示梓醇可增强脑缺血后新生轴突形成新的突触连接,促进脑缺血后有效轴突芽生。 (4)梓醇上调缺血灶周围大脑皮质BDNF蛋白表达BDNF阳性细胞被Cy3标记,胞浆和突起呈现红色,胞核不着色,阳性细胞主要为神经元。BDNF阳性细胞数模型组和生理盐水组均较假手术组明显增加(P<0.05),提示脑缺血后BDNF表达上调;梓醇治疗组均比模型组明显增加(P<0.05),且梓醇中、高剂量治疗组也比胞磷胆碱组明显增加(P<0.05)。Western blot检测结果与此相符。提示梓醇可上调脑缺血后BDNF蛋白表达。 (5)梓醇上调缺血灶周围大脑皮质TrkB蛋白表达TrkB阳性细胞胞浆和突起被FITC标记,呈现绿色,胞核不着色。缺血灶周围大脑皮质TrkB阳性细胞数模型组较假手术组有减少趋势,但差异无显著性(P>0.05);梓醇中剂量治疗组明显多于模型组和胞磷胆碱组(P<0.05)。Western blot检测结果与此相符。提示梓醇可上调脑缺血后TrkB蛋白表达。 结论: 梓醇可下调脑缺血后脑组织内Nogo-A和NgR蛋白表达,促进神经元轴突和树突生长;可上调脑缺血后BDNF和TrkB蛋白表达,增强突触重构;明显促进脑缺血后受累肢体神经功能恢复;是一种极具潜力的促进脑缺血后神经修复的候选药物。
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